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研究方向
 

病原生物学安徽省重点实验室(安徽医科大学)

人畜共患病安徽高校省级重点实验室(安徽医科大学)

主要研究方向

  

1、弓形虫致病机理研究:

1)我国弓形虫优势基因型效应分子ROP16/GRA15多态性及其致不良妊娠结局的机制研究

弓形虫寄生在有核细胞内,其垂直传播严重危害人类健康和畜牧业生产。近年发现,部分抗体阳性孕妇流产的病理组织中难以查见虫体和DNA。已知弓形虫毒力分子具有基因型相关的多态性,I/IIIII型虫株ROP16GRA15的多态性分别驱动巨噬细胞向M2M1极化,诱导宿主迥异的免疫应答,可能是部分妊娠失败的主要原因。我国的弓形虫优势基因型虫株Wh3兼具I/IIIROP16IIGRA15的多态性,其诱导母-胎界面的免疫失衡致流产可能具有独特的致病机制。团队成员将采用ROP16I/IIIGRA15II重组病毒转染巨噬细胞、活化的M2M1分别与滋养细胞和Th17共培养、体内转输、ROP16I/III基因敲除虫株感染等,揭示ROP16I/IIIGRA15II诱导的滋养细胞凋亡和Wh3致流产的机制,为弓形虫基因型相关的致病机制和我国的优势基因型弓形虫病防治提供实验和理论依据。

2)弓形虫毒力分子棒状体蛋白18ROP18)致病分子机制

弓形虫速殖子是其主要的致病阶段。 ROP18是由速殖子棒状体分泌的丝/苏氨酸蛋白激酶,是决定虫体毒力和增殖能力的关键蛋白,但确切机制不清。团队前期研究显示ROP18可以促进宿主神经细胞凋亡。本研究拟采用酵母双杂交方法,筛选与弓形虫毒力因子 ROP18 相互作用的宿主蛋白;通过体外磷酸化实验及免疫共沉淀技术明确 ROP18 和宿主蛋白之间的相互作用和磷酸化位点;检测凋亡相关通路关键蛋白的变化。

弓形虫还是一种重要的生物致畸因子,其导致的先天性脑病严重损害婴幼儿健康。神经干细胞(NSC)在神经系统发育和病理机制中起关键作用。团队成员前期研究显示,弓形虫分泌排泄物可抑制NSC分化,其中棒状体蛋白18ROP18)能抑制Wnt/β-catenin信号通路,从而显著降低NSC内β-catenin以及下游参与神经干细胞分化的Ngn1Nng2表达,提示ROP18可调控Wnt/β-catenin信号途径干扰NSC分化。我们将采用小鼠原代NSC及其细胞系C17.2以及弓形虫ROP18的缺失突变体,以rROP18转染、胞内共定位、siRNA敲低和回补等,观察NSC形态以及分化标志物、ROP18磷酸化并降解β-catenin及与GSK3β的协同作用等,旨在揭示 ROP18NSC分化与Wnt/β-catenin信号通路的抑制与分子调控机制。上述研究将完善弓形虫致病的分子机制,为弓形虫病的防治提供新的理论和实验依据。

3)弓形虫多态效应分子GRA15Ⅱ调节巨噬细胞极化及其抗肝细胞癌作用的研究

肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境内浸润最为丰富的免疫炎性细胞,在肿瘤生物行为学上发挥重要作用。已知巨噬细胞具有可塑性,肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤细胞分泌的相关因子的作用下极化为M2型,促进肿瘤增殖、侵袭和转移,因此成为肿瘤免疫治疗的重要靶点。弓形虫多态效应分子GRA15Ⅱ能够通过NF-κB途径驱动巨噬细胞向M1极化,其有可能逆转肿瘤相关巨噬细胞从M2M1极化,改变微环境中M2/Th2的优势应答,发挥杀伤肿瘤细胞和抑制血管生成功能。本研究采用我国的弓形虫优势基因型虫株多态效应分子GRA15Ⅱ重组腺病毒转染巨噬细胞,与不同转移潜能的肝癌细胞株共培养、肿瘤原位注射小鼠肝癌模型等,观察弓形虫多态效应分子GRA15Ⅱ在肿瘤微环境中调节巨噬细胞的M1极化,延滞肿瘤进展的作用,深入探讨肿瘤相关巨噬细胞的免疫调节机制,为肿瘤免疫治疗提供新思路和新策略,为开发新药物提供基础。

2、血吸虫免疫调控及防治研究:

1)血吸虫亮氨酸氨基肽酶和果糖二磷酸醛缩酶诱导负向免疫调控机制的研究

蠕虫感染诱导的宿主Th2免疫偏移已成为感染免疫调节研究的重要模型。血吸虫感染早期,宿主呈现Th1优势应答,随后出现Th2免疫偏移,其负向免疫调控的机制至今尚未明了。团队成员已筛选、克隆表达出了虫源性糖蛋白亮氨酸氨基肽酶(SjLAP)和果糖二磷酸醛缩酶(SjFBPA),发现能够显著诱导宿主Th2免疫极化,推测可模拟偏移应答模型。在未来的研究中拟利用感染小鼠和CIA模型鼠,在体内外系统研究SjLAP SjFBPATh1/Th2Treg/Th17M1/M2平衡的负向调控,观察其对CD4CD25Foxp3+调节性T细胞(Treg)、旁路途径激活的巨噬细胞(M2)、Tim-3-Galectin-9通路介导的Th1凋亡和抑制的影响;采用MACS分离,FCM和芯片检测,结合microRNA表达,以揭示虫体免疫逃避、宿主免疫耐受、免疫偏移、免疫病理以及疫苗失能的分子机制。

2)血吸虫肝纤维化研究

血吸虫病是目前不容忽视的全球性社会公共卫生问题,虫卵肉芽肿导致肝纤维化及其并发症是病人致死的主要原因。临床和基础研究业已发现Th17在自身免疫性疾病中所发挥的作用。RORγt是促进Th17细胞分化增殖的关键性转录因子,且RORγt的表达、翻译后修饰状态及其稳定性决定TH17的功能发挥。大量资料以及我们自己的结果已经证实血吸虫肉芽肿的发生发展与IL-17密切相关,前期预实验已证实了Th17细胞中的RORγt可与乙酰转移酶p300相互作用,p300能够介导RORγt蛋白的稳定并增强其转录活性。团队成员将用免疫共沉淀、pull down实验和荧光素酶报告基因等技术明确p300介导的RORγt翻译后修饰变化的调节作用方式,以及p300作用RORγt对血吸虫虫卵引起的肉芽肿及肝纤维化的分子机制,在Th17细胞分化起始的上游寻找关键调节因子,为临床治疗血吸虫病及纤维化的新药提供靶点及相关实验依据。

逆转肝纤维化是继杀虫及抑制肝纤维化疗法后治疗日本血吸虫病的另一个关键环节,但目前国内外仍无可逆转肝纤维化的药物用于临床。前期研究证明,日本血吸虫病肝组织中替代激活的巨噬细胞(AAMs)能促进肝纤维化。经典激活的巨噬细胞(CAMs)可能逆转肝纤维化,且Ⅱ型弓形虫致密颗粒蛋白15GRA15)能不依赖模式受体而活化CAMs。本团队成员将gra15基因克隆入慢病毒中并感染巨噬细胞,使其活化为CAMs,然后经静脉将其注入日本血吸虫病肝纤维化小鼠体内,对比研究CAMs对肝肉芽肿、肝纤维化、肝星状细胞(HSCs)、促纤维因子及溶纤维因子等的影响;将小鼠的原代HSCsCAMs共培养,对比研究CAMs的分泌产物对HSCs致纤维化的影响,以阐明CAMs逆转日本血吸虫病肝纤维化的部分机制,为研发新的抗纤维化多肽药物提供理论基础和实验依据,也为将来研发生物新药探索新的药物来源。

3)日本血吸虫生殖调控网络中VasaNanos的功能及其主开关靶点的鉴定

血吸虫虫卵是致病和传播流行的最重要因素,对血吸虫生殖细胞及虫卵发生发育的研究是血吸虫病防治重要的方向之一。VasaNanos蛋白是多种生物生殖细胞发育的功能蛋白,为生殖细胞包括生殖干细胞特化和存活所必须。本研究将首先应用各期整虫标本蛋白和基因的定位技术,明确VasaNanos可做为血吸虫生殖细胞包括原始生殖细胞的分子标志物;应用RNA干扰技术揭示VasaNanos蛋白在血吸虫虫卵发生、发育及活性维持中所具有的功能;再应用蛋白质相互作用技术了解VasaNanos是否协同发挥功能,并试图发现新的与VasaNanos相互作用蛋白;最后再利用RNA干扰技术,确定新发现的相互作用蛋白对二者的调节作用并追踪其主开关靶点所在。通过本研究期望发现可干预和抑制血吸虫虫卵发生发育关键靶标,为研发抑制血吸虫虫卵发育及活性的药物或制剂提供理论和实验依据,探索控制血吸虫病流行和减轻血吸虫对人体危害新途径。

3、细菌耐药及细菌毒力因子调控研究:

1)细菌耐药及其发生机制与对策研究

细菌耐药问题日趋严重,对人类健康造成极大威胁,成为全球关注的热点细菌耐药性的产生与目前抗菌药的滥用有着重要关联。近年来,耐药细菌越来越多,耐药范围越来越广,程度越来越高,多重耐药菌不断出现。 在抗菌药应用的早期,几乎所有细菌感染性疾病都很容易治愈。随着抗菌药的大量和长期使用,出现了越来越多的多重耐药细菌。在畜牧养殖业中。为防止疾病感染及促进动物生长,大量的抗菌药被应用于饲料中,由于剂量不足及残留造成了耐药菌株的出现及耐药性的传播,并且耐药性可通过食物链转移到人群,从而极大地危害了人类自身的安全。细菌耐药性产生包括生化机理和基因机理,重要的生化机理包括抗菌药破坏酶的产生、靶位的改变和主动外排系统的出现。细菌耐药性的基因机理主要包括基因的突变和外源抗性基因的获得。团队成员将对安徽省临床分离细菌株进行耐药性的监测,并通过PCRDNA序列分析、克隆表达、整合子及DNA指纹图谱分析、PFGE等方法,了解qnr基因、KPC酶、碳青霉烯酶和ESBLs基因等在革兰阴性菌杆,尤其是大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌等肠杆菌科细菌中的分布、流行情况、基因型与表型的关系、携带该基因的整合子的结构和类型。并对前期发现的qnr基因新亚型的功能进行进一步研究,为耐药菌的防治和临床合理用药提供实验室依据。

2)金黄色葡萄球菌非编码小RNA相互作用蛋白的探寻及功能研究

金黄色葡萄球菌,是引起化脓性感染的重要人畜共患致病菌,能引发表皮感染,甚至心内膜炎、感染性皮炎、奶牛乳房炎及多种感染性疾病。细菌非编码小RNAsRNA)在细菌生理调节及致病菌毒性调控中具有重要的作用,近年来金黄色葡萄球菌中sRNA对致病性调控的机制研究已成为研究热点。sRNA通过与mRNA直接相互作用进而调其稳定性或者翻译起始的机制已被研究得较为透彻,然而依靠蛋白质分子参与的细菌sRNA合成和调控过程仍少有报道。我们通过前期探索,确立了以链霉亲和素RNA适配体为Tag来进行RNA-蛋白质pull down的实验手段,并成功利用这种方法对金黄色葡萄球菌中重要sRNA的结合蛋白进行了搜寻和鉴定。团队成员拟在上述基础上,系统鉴定并验证金黄色葡萄球菌中潜在的重要sRNA结合蛋白,深入研究这些蛋白对于sRNA稳定性影响及在其调控网络的作用,阐明RNA结合蛋白在sRNA致病性调控中的功能与地位,进而完善金黄色葡萄球菌sRNA的分子调控网络,以期为金黄色葡萄球菌的防治提供新的靶标与切入点。